生物工程是一門(mén)新型的跨學(xué)科技術(shù),它涉及范圍十分廣泛,科學(xué)家通常把基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程,看成是構(gòu)成生物工程的4大生物技術(shù)。
基因工程主要指基因重組技術(shù)。它是根據(jù)生物遺傳規(guī)律,使用類似工程設(shè)計(jì)的方法,在體外利用限制性內(nèi)切酶把來(lái)自不同生物的遺傳基因進(jìn)行“拼接”,使之重新組合。然后通過(guò)基因轉(zhuǎn)移載體如質(zhì)?;虿《镜?,把重組基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞,進(jìn)行無(wú)性繁殖,并使新的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá),從而生產(chǎn)出人類需要的物質(zhì)或創(chuàng)造出新的生命類型與生物品種來(lái)。
細(xì)胞工程是指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論與方法,按照人們的需要和設(shè)計(jì),在細(xì)胞水平上的遺傳操作,重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物,以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能,即通過(guò)細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法,快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。
細(xì)胞工程與基因工程一起代表著生物技術(shù)發(fā)展前沿,伴隨著試管植物、試管動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器等相繼問(wèn)世,細(xì)胞工程在生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。
基因工程和細(xì)胞工程相關(guān)科研實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)常需要分離核酸、蛋白質(zhì)、核糖體亞基及其它成分;在疾病預(yù)防及控制領(lǐng)域,經(jīng)常需要純化病毒,諸如此類的實(shí)驗(yàn)離不開(kāi)使用密度梯度離心(density gradient centrifugation)。
密度梯度離心是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫,蔗糖和多聚蔗糖。
差速區(qū)帶離心法:此法與顆粒的密度無(wú)關(guān),大小相同,密度不同的顆粒(如線粒體,溶酶體等)不能用此法分離,僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒(20% 的沉降系數(shù)差或更少)或分子量相差3倍的蛋白質(zhì), 等密度區(qū)帶離心法。
梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液,其大折射率(密度)和濃度可達(dá)1.44193(密度1.28g/cm3)和 60%。
等密度離心法:它的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差,密度差越大,分離效果越好,與顆粒大小和形狀無(wú)關(guān),但大小和形狀決定著達(dá)到平衡的速度、時(shí)間和區(qū)帶寬度。
梯度介質(zhì)通常為氯化銫CSCl,其大折射率(密度)和濃度可達(dá)1.39943(密度1.699g/cm3)和 56%。此法可分離核酸、亞細(xì)胞器等,也可以分離復(fù)合蛋白質(zhì),但簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)不適用。
無(wú)論是使用蔗糖溶液,氯化銫溶液還是其它作為梯度介質(zhì),其預(yù)制以及離心分離后目標(biāo)物質(zhì)的確認(rèn)都離不開(kāi)折射率或者濃度測(cè)量。同時(shí),用于分離的樣品量通常都很小,而且目標(biāo)物質(zhì)層還需要收集供下一步實(shí)驗(yàn)。這就要求檢測(cè)該折射率或濃度時(shí),所需的樣品量也是越少越好。
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